M9 medium recipe for Se-Met substitution

Medium for Se-Met substituttion (per litre)

-10X M9 medium: 100 ml + DW (autoclave)

=> Autoclave 후 아래 물질들을 filter로 멸균한 후 추가로 첨가

-100X trace elements solution: 10 ml (filter)

-20% (w/v) Glucose : 30 ml (filter)

-1M MgSO4 : 1 ml (filter)

-1M CaCl2: 0.3 ml (filter)

-thiamin (1mg/ml) : 1ml (물에 잘 안 녹음, filter 하지 말고 suspension 상태로 넣기)

- Amino acid 각 100 mg씩

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10X M9 medium (per litre) – pH 7,4 with NaOH

-Na2HPO4: 80g

-KH2PO4: 40g

-NaCl: 5g

-NH4Cl: 5g

 

100X Trace elements solution (per litre) – filter sterilized

-EDTA: 5g

-FeCl3 * 6H20: 0.83g

-ZnCl2: 84mg

-CuCl2 * 2H2O: 13mg

-CoCL2 * 6H2O: 10mg

-H3BO3: 10mg

-MnCl2 * 6H2O: 1.6mg

 

Amino acid (per litre) – powder를 직접 넣기 (AA 종류별로 넣으면 더 잘 크나 아래 4개만 넣어도 충분)

-Arginine, Glu, Phe, Lys: 100mg

-Se-Met: 100mg

 

- M9 medium need B834 competent cell (Methionine auxotroph)

- seed culture (LB)는 3,000 rpm 10 min-centrifuge해 LB 버리고 M9 medium으로 resuspension 후 3,000 rpm 10min-centrifuge으로 washing (20 ml 2회)

- M9 medium으로 washing한 mini culture(M9 20 ml)을 1.5L M9 medium에 담고 O/N으로 키워야 OD=0.7 도달