TA nano ITC (Isothermal titration calorimetry) protocol
l sample preparation
1. sample은 같은 buffer 에 dialysis 시킨다. phosphate buffer가 좋으며 beta-mercaptoethanol 이나 DTT가 들어가면 안됨.
- 2시간, O/N two step으로 진행
2. ligand는 dialysis 시킨 buffer에 녹여야 buffer에 의한 열의 변화를 무시할 수 있다.
3. ligand의 농도는 protein sample의 10배는 되어야 한다.
l ITC protocol
- 모든 buffer는 완전히 degassing 해서 사용
- TDW, buffer, 킴테크, waste 통 준비
- 단계마다 loop을 DW로 잘 씻을 것
- loading시 loop의 끝 부분이 바닥에 닿기 직전까지만 넣고 loading
- loading시 loop이 벽에 닿아 기스가 생기지 않도록 조심
1. sample cell, reference cell 에 DW를 넣고 O/N으로 기계 안정화 (“ITC run” S/W 실행)
(ref cell에 끼워져 있는 마개는 핀셋으로 집어야 함)
2. buffer를 vial에 담고 stirrer를 넣은 후, ITC 옆 degassing 기계를 이용해 degassing 한다. (Temp 25도씨, stir 500 rpm 설정 후 Vacuum on)
- 최소 10 min, 단백질의 경우 더 낮은 rpm 에서 진행
- Vac on 이후 뚜껑을 눌러서 vacuum이 제대로 걸리는지 확인
3. degassing하는 동안 sample, ref cell의 DW를 빼주고, reference cell에 TDW를 다시 채워준다.
4. sample cell에 sample을 loading 한다.
5. 100 ul syringe에 ligand를 넣고 syringe 끝에 공기가 조금만 남아있도록 조절한다. 이후 syringe를 holder에 끼운 후 기기에 살살 장착한다.
(적당히 들어간 후 돌려서 걸리는 곳에서 눌러서 돌리면 장착됨)
6. “TC run” S/W의 ‘set up’에서 setting한 후 ‘stirring rate’의 옆 실행 버튼을 누른 후 상단의 실행 버튼을 눌러서 실행
- stirring rate: 200 rpm
- syringe size: 100ul
- temperature: 25도씨
- Incremental titration: set up – 3ul, 33회
- Auto equilibrate: Medium
- Initial baseline: 1000s
- Final baseline: 300s