[PCR] vector 삽입을 위한 gene cloning용 primer 제작 단계

분자생물학 기반의 거의 모든 바이오 연구실에서는 vector에 원하는 target gene을 삽입할 일이 비일비재합니다. 

이 때 target gene에 restriction enzyme의 cleavage site를 넣기 위해 polymerase chain reaction(PCR)을 진행하는데, 

아래는 PCR에서 사용하는 primer 제작 단계입니다. 

Forward primer와 Reverse primer 각각에 서로 다른 restriction enzyme cleavage site를 넣고, 

sticky end를 만드는 restriction enzyme을 이용한다는 가정을 하겠습니다. 

(PCR이나 제한효소, primer 관련 기초 지식은 구글에 검색하시면 매우 많이 나옵니다.)

1. 먼저 cloning에 사용할 vector map을 확인합니다. 판매되는 vector의 map을 보시면 사용할 수 있는 restriction enzyme의 종류를 알 수 있습니다.

2. PCR로 복제하려고 하는 target gene의 sequence 확인합니다. 사용하려는 restriction enzyme이 인식하는 cleavage site가 내부에 포함되면 잘려버리겠죠?

   이 때 확인은 다음 사이트에서 할 수 있습니다.  > DNA 5(https://pga.mgh.harvard.edu/web_apps/web_map/start) *띄어쓰기 없도록 주의

3. vector에 사용할 수 있으면서 target gene의 sequence 상에 cleavage site가 존재하지 않는 restriction enzyme을 두 개 선택합니다.

4. vector map 상에 protein 정제를 위해 발현되는 tag이 존재한다면 나중에 발현시킬 때 translation이 잘 되도록 frame을 조정합니다. 하나라도 어긋나게 되면 codon이 달라져 다른 아미노산이 합성되게 됩니다. 

   이 때 조정은 위에서 사용했던 사이트에서 할 수 있습니다. > DNA 5 사이트의 'Detail'에서 'Frames Wanted' 조절

5. Forward primer의 5'에 선택한 두 개 restriction enzyme 중 vector map 상에서 5'에 더 가까운 것을 하나 선택하여 restriction enzyme cleavage site 넣어서 제작합니다. Reverse primer에는 다른 하나의 restriction enzyme의 cleavage site을 5'에 넣어서 마찬가지로 진행합니다. 

6. 5'에 GGA 등 최소 3개를 추가로 넣고, 3'에는 C나 G로 끝나도록 합니다. (CC, CG 등으로) 이는 이중결합으로 이루어지는 A, T와는 달리 C, G는 삼중결합을 하여 더 결합이 잘 되기 때문에 효율이 높아지는 경향이 있습니다.

7. 마지막으로 단백질을 발현시켰을 때 원하는대로 될 것인지 확인하기 위해 primer를 translation 시켜서 amino acid 서열을 확인합니다.

   이 때 확인은 다음 사이트에서 할 수 있습니다.  > ExPASy (http://web.expasy.org/translate/)

8. GC content와 melting temperature(Tm)를 확인합니다. 위에서 말씀드렸듯이 G, C는 삼중결합을 하기 때문에 G, C의 비율이 높을수록 더욱 세게 결합하는 경향이 있습니다. 적절한 결합 정도를 유지하기 위해 G, C content가 60% 전후가 되는 것이 좋습니다. Tm의 경우도 70도 이상이면 PCR 효율이 낮아지는 경향이 보입니다. 

   이 때 확인은 다음 사이트에서 할 수 있습니다.  > PCR primer stat (http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html)

위에서 제작한 primer를 이용한 PCR 과정을 그림으로 요약하면 다음과 같습니다.

다들 cloning에 성공하시길 기원하며..!